6. 结论和观点

SARS-CoV-2 仍然是一个重大的全球挑战，给经济带来压力，并对公共卫生构成持续威胁。本综述的重点是检查与 SARS-CoV-2 刺突蛋白相互作用的 ACE2 以外的附着因子和替代受体。此外，我们还讨论了当前旨在减少这些相互作用和限制感染的治疗策略。SARS-CoV-2 广泛的组织和细胞嗜性可能是由于它能够利用附着因子和替代受体进入宿主细胞。这为未来的研究开辟了有希望的途径。首先，进行诱变和结构研究可以揭示来自 SARS-CoV-2 变体的刺突蛋白是否对附着因子或替代受体表现出不同的结合亲和力。反过来，这可以为驱动 SARS-CoV-2 传播和发病机制的机制提供关键见解。其次，未来对 SARS-CoV-2 进入机制的研究应考虑非 ACE2 受体的作用，结合检测细胞表面蛋白的方法。第三，调查不同种族或民族人群之间是否存在非 ACE2 附着因子/替代受体表达的变异，以及这些差异如何影响对感染的易感性，将是一个有价值的研究领域。最后，应在动物模型中进一步评估靶向非 ACE2 细胞受体和分子的潜在益处和风险。

3. SARS-CoV-2 进入：替代受体（ACE2 非依赖性）

我们将“替代受体”定义为在没有 ACE2 表面表达的情况下介导 SARS-CoV-2 进入的细胞蛋白。在本节中，我们检查满足这些标准的蛋白质，并按其组织或细胞表达对它们进行分组。这包括 TfR、CD147、ASGR1/KREMEN1、AXL 和 TMEM106B（表 2;图 2B).

3.1. 转铁蛋白受体 （TfR）

转铁蛋白受体 （TfR） 介导铁的摄取和运输，并在人体中普遍表达 （Wessling-Resnick， 2018）。TfR 是同型二聚体 II 型跨膜蛋白，每个单体由三个细胞外结构域（一个蛋白酶样结构域、一个负责二聚化的螺旋结构域和一个控制配体结合的顶端结构域）、一个跨膜结构域和一个短细胞质尾部组成（Montemiglio等人，2019 年).TfR 的细胞外结构域类似于蝴蝶状。TfR 定位于质膜，许多有包膜和无包膜的病毒，如新世界出血热沙粒病毒、丙型肝炎病毒 （HCV） 以及人和犬细小病毒使用 TfR 进入宿主细胞（Parker 等人，2001 年;Wessling-Resnick，2018 年）。

2024 年，Liao 等人确定人类 TfR 是介导 SARS-CoV-2 感染的受体（Liao et al.， 2024）。研究人员采用串联亲和纯化质谱 （TAP-MS） 来鉴定与 Spike 相互作用的蛋白质。TAP-MS 使用两步亲和纯化方法鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，然后进行基于质谱的蛋白质鉴定（Gingras等人，2007 年）。为了鉴定 Spike 相互作用蛋白，将人肺细胞 （Calu-3） 裂解物与 SARS-CoV-2 Spike 一起孵育，然后依次用 S1 和 S2 抗体对蛋白质复合物进行免疫沉淀，然后使用液相色谱串联质谱法进行分析。这产生了 293 个刺突相互作用伴侣，其中 42 个是跨膜蛋白，9 个在细胞膜上表达，2 个与病毒进入有关：ACE2 和 TfR。有趣的是，TfR 在小鼠的气管和肺中高度表达，并且 TfR 肺表达在猴子和人源化 ACE2 小鼠感染 SARS-CoV-2 后增加。ELISA、SPR 和 Co-IP 实验表明，SARS-CoV-2 刺突蛋白直接与人 TfR 结合，但不与小鼠或仓鼠 TfR 结合。有趣的是，在对 SARS-CoV-2 耐药的婴儿仓鼠叙利亚肾细胞 （BHK-21） 和 C57 小鼠中表达人 TfR，导致它们独立于 ACE2 感染。由于 TfR 病毒复合物位于细胞表面和内体内，这表明 TfR 可能作为替代受体，在非 ACE2 或 TMPRSS2 表达的细胞中促进 SARS-CoV-2 内吞作用。未来的研究应解决 TMPRSS2 在 TfR/SARS-CoV-2 进入中的作用以及 COVID-19 患者人体组织中 TfR 的表达水平。

3.2. CD147的

人类分化簇 147 （CD147） 也称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂 （EMMPRIN）、HAb18G 和 basigin 是一种 I 型跨膜蛋白和免疫球蛋白 （Ig） 超家族的成员，普遍表达并在胎儿、神经元、淋巴细胞和癌症发展中发挥重要作用（Gabison et al.， 2005）。CD147 包括两个 Ig 样结构域、一个跨膜结构域和一个短细胞质尾部 （Gabison et al.， 2005）。CD147 存在四种亚型，尽管亚型 2 是最广泛表达和研究最充分的 （Gabison et al.， 2005）。多种病原体使用 CD147 来增强感染。CD147 是人类疟疾寄生虫恶性疟原虫进入红细胞（红细胞）的必需受体（Crosnier等人，2011 年;Zhang et al.， 2018）。致病菌脑膜炎奈瑟菌使用 CD147 进入人内皮细胞，导致脑内血管定植（Bernard et al.， 2014）。与 HIV-1 衣壳结合的宿主蛋白亲环蛋白 A （CypA） 可以与 CD147 相互作用，从而增强 HIV-1 感染（Pushkarsky et al.， 2001）。此外，SARS-CoV 核衣壳 （N） 也与 CypA 结合，CD147 抑制肽的表达减少了 SARS-CoV 感染（Chen等人，2005 年）。CD147 作为 SARS-CoV-2 感染的替代受体的作用是决定性的。Wang 等人的初步报告使用 SPR、ELISA 和 Co-IP 测定检测到 SARS-CoV-2 刺突 RBD 和 CD147 之间存在相互作用（Wang等人，2020 年）。电子显微镜在病毒感染的 Vero E6 细胞以及从 COVID-19 患者分离的肺和肾组织中检测到 CD147 和 Spike 之间的共定位。通过 shRNA 沉默 CD147 减少了 Vero E6 和 BEAS-2B 细胞系中的 SARS-CoV-2 感染。相反，在不敏感细胞系 BHK-21 中过表达 CD147 会增强感染。此外，在人 CD147 （hCD147） 的肺部检测到 SARS-CoV-2，但在野生型 （WT） 小鼠的肺中未检测到。尽管在 COVID-19 患者肺组织的淋巴细胞中检测到病毒颗粒，但未发现 CD147 和 ACE2 之间存在直接相互作用或共定位。在活化的 CD4 和 CD8 T 细胞中，CD147 的表达增加，但 ACE2 的表达增加。这导致 SARS-CoV-2 假病毒感染增加。最后，对 COVID-19 患者的易感细胞系 （BHK-21-CD147） 和肺组织的电子显微镜显示，SARS-CoV-2 可能通过 CD147 介导的内吞作用进入细胞。这些结果表明 CD147 作为替代受体，特别是在低 ACE2 表达细胞（如肺和气管）中。

⁺⁺

相比之下，两项独立的随访研究发现 CD147 和 SARS-CoV-2 Spike 之间没有相互作用（Ragotte等人，2021 年;Shilts等人，2021 年）。Shilts 及其同事生产了重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白和 CD147 蛋白，并使用生化分析来测试它们的相互作用，发现它们之间几乎没有结合。此外，敲低人肺上皮细胞系 （Calu-3） 中的 ACE2 消除了他们对 SARS-CoV-2 感染的易感性，而敲低 CD147 或 MHC-I 蛋白 β-2-微球蛋白 （B2M） 则没有（Shilts等人，2021 年）。同样，Ragotte 及其同事表明，RBD 或全长刺突均未与细菌或哺乳动物细胞中的 CD147（亚型 2）结合，而 CD147 与来自恶性疟原虫的网织红细胞结合蛋白同源物 5 （RH5） 之间存在强烈的相互作用（Ragotte等人，2021 年）。鉴于这些结果，目前尚不清楚 CD147 在 SARS-CoV-2 感染中的确切作用。未来的研究应寻求确定 CD147 亚型和/或多种刺突蛋白之间是否发生差异结合。

3.3. ASGR1 & KREMEN1

唾液酸糖蛋白受体 1 （ASGR1） 是一种内吞循环受体，可结合血液中积液酸糖蛋白并促进它们在肝脏内的内吞作用和溶酶体降解 （Ashwell 和 Harford， 1982）。与 DC/L-SIGN 一样，ASGR1 是一种 CLR，它使用其细胞外碳水化合物识别结构域 （CRD） 来识别配体，主要在肝细胞（肝细胞）表面表达（Hoober，2020）。丙型肝炎病毒 （HCV） 被认为使用 ASGR1 进入肝细胞（Cocquerel 等人，2006 年;Saunier et al.， 2003）。含有跨膜蛋白 1 （KREMEN1） 的 Kringle 是一种参与调节 Wnt/β-catenin 信号转导的 I 型跨膜受体 （毛 et al.， 2002）。该蛋白质具有细胞外 Kringle、WSC 和 CUB 结构域，这些结构域对于配体和共受体相互作用至关重要（Zebisch等人，2016 年）。KREMEN1普遍表达，在皮肤和食管中表达特别高，并作为许多肠道病毒的进入受体（Staring等人，2018 年）。

2022 年，Gu 及其同事确定含有跨膜 1 （KREMEN1） 的唾液酸糖蛋白受体 1 （ASGR1） 和含有 Kringle 的替代受体是 SARS-CoV-2 进入的替代受体（Gu et al.， 2022）。为了鉴定 ACE2 以外的 SARS-CoV-2 受体，在 HEK293 细胞中单独表达编码 5054 个人膜蛋白编码基因的质粒，并通过流式细胞术测量它们与 SARS-CoV-2 刺突细胞外结构域 （S-ECD） 的结合。该筛选确定了 12 种结合 Spike 的膜蛋白，包括 ASGR1 和 KREMEN1 （Gu et al.， 2022）。有趣的是，KREMEN1 和 ASGR1 的表达足以使 Spike 假型 SARS-CoV-2 进入 ACE2-KO HEK293T细胞，但不能进入 SARS-CoV 或 MERS-CoV。ASGR1 和 KREMEN1 都允许 Spike 假型 SARS-CoV-2 颗粒附着在细胞表面，并且两种蛋白质都与 Spike 共定位。这些结果已通过真实的 SARS-CoV-2 得到证实。为了确定 ASG1 和 KREMEN1 在体内的作用，编码人 ASGR1、KREMEN1 或 ACE2 的慢病毒颗粒在小鼠鼻内表达，然后用 SARS-CoV-2 刺突假病毒或正宗 SARS-CoV-2 攻击。与对照组相比，肺内表达 ACE2 、 ASGR1 和 KREMEN1 的小鼠的病毒滴度显著升高。有趣的是，虽然 ACE2 仅与刺突 RBD 结合，但 KREMEN1通过其 CUB 结构域与刺突 RBD 和 NTD 结合，而 ASGR1 通过其 CTD 结构域结合刺突细胞外结构域内的所有三个区域（RBD、NTD 和 S2）。因为存在针对 Spike NTD 的中和抗体（Brouwer等人，2020 年;Chi et al.， 2020;Liu et al.， 2020），这表明 KREMEN1 和 ASGR1 与 AXL 一样，可能对建立 SARS-CoV-2 感染很重要。接下来，Gu 等人筛选了 39 种肺癌和肝癌细胞系，确定了 13 种易受 SARS-CoV-2 感染的影响。在 ACE2 中和抗体存在下共孵育 SARS-CoV-2 假病毒可抑制大多数细胞系的病毒感染，肺 （HTB182） 和肝脏 （Li7） 细胞系除外。相反，敲低 HTB-182 细胞中的 KREMEN1 或 Li7 细胞中的 ASGR1 可显著降低其对正宗 SARS-CoV-2 的感染。分析单细胞 RNA 测序数据确定 ACE2、ASGR1 和 KREMEN1，统称为 ASK 受体，在 COVID-19 患者上呼吸道的上皮细胞和免疫细胞中均显著表达。总的来说，这些发现表明 KREMEN1 和 ASGR1 代表独立于 ACE2 的 SARS-CoV-2 进入的替代受体。

3.4. 斧头

AXL/UFO 是一种受体酪氨酸激酶 （RTK），最初在慢性粒细胞白血病患者中被发现 （Liu et al.， 1988）。该蛋白质包含细胞外、跨膜和细胞内结构域，其中细胞外区域由两个免疫球蛋白 （Ig） 样重复序列和两个纤连蛋白 III 型 （Fro II） 样重复序列组成，它们参与结合配体 Gas6 （Linger et al.， 2008）。激酶活性源于 AXL 的细胞内结构域。与 Tyro3 和 Mer 一起，Axl 是 RTK 的 TAM 家族的一部分，该家族在包括血液、大脑、心脏和肝脏在内的多种组织中广泛表达（Linger et al.， 2008）。TAM 受体调节细胞存活并在免疫系统发育中发挥多种作用 （Linger et al.， 2008）。AXL 是黄病毒的宿主进入因子，包括登革热病毒 （Meertens et al.， 2012） 和寨卡病毒 （Meertens et al.， 2017）。

Wang 及其同事使用 TAP-MS 确定了人肺 （H1299） 和支气管 （BEAS-2B） 上皮细胞 （S. Wang等人，2021 年） 中 SARS-CoV-2 刺突和 AXL 之间的相互作用。在这里，研究人员在 H1299 和 BEAS-2B 细胞中稳定表达带有亲和纯化标签 （S/SBP） 的刺突或对照流感 H5N6 血凝素 （HA），称为诱饵蛋白。使用 Strep （SBP） 和 S 珠进行串联亲和纯化后，使用液相色谱质谱 （LC MS/MS） 鉴定与 Spike 或 HA （猎物） 相互作用的蛋白质。统计建模和计算筛选确定 AXL、表皮生长因子受体 （EGFR） 和低密度脂蛋白受体 （LDLR） 是 Spike 的主要受体，尽管只有 AXL 与细胞膜的 Spike 共定位。有趣的是，AXL 与 Spike 的 N 端结构域 （NTD） 结合，而不是 RBD。这很有趣，因为从 COVID-19 患者中分离的一些单克隆抗体与 Spike RBD 以外的位点结合（Brouwer等人，2020 年;Chi et al.， 2020;Liu et al.， 2020）。在不敏感的 HEK293T 细胞中过表达 AXL 或 ACE2 促进了 SARS-CoV-2 假病毒和真正的 SARS-CoV-2 感染。相反，敲除 H1299 细胞和原代人肺类器官中的 AXL 减少了，但并未完全消除 SARS-CoV-2 感染。AXL 阳性细胞与 COVID-19 患者支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中的 SARS-CoV-2 阳性细胞的相关性高于 ACE2 阳性细胞。由于 ACE2 在人肺和气管中的表达较低（S. Wang et al.， 2021），这些发现表明 AXL 可以作为 SARS-CoV-2 进入人肺上皮细胞的替代受体，独立于 ACE2。

3.5. TMEM106B

TMEM106B 是一种 II 型晚期内体/溶酶体跨膜蛋白，主要在大脑、心脏、甲状腺、肾上腺和睾丸中表达（Lang等人，2012 年;Uhlén等人，2015 年）。该蛋白质包含一个 N 末端胞质结构域、一个跨膜结构域和一个糖基化 C 末端管腔结构域 （LD），该结构域可以在与溶酶体蛋白酶结合时解离（Feng等人，2021 年）。TMEM106B 可以与其同源物TMEM106C结合形成同源二聚体和异二聚体（Stagi等人，2014 年）。几种溶酶体蛋白可以结合TMEM106B，包括蛋白酶组织蛋白酶 D（Feng等人，2020 年），TMEM106B参与多种溶酶体功能，包括维持溶酶体 pH 值和调节溶酶体运动和胞吐作用。TMEM106B水平的改变与多种神经认知障碍有关，例如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症 （ALS）、额颞叶变性 （FTLD） 和帕金森病（Feng et al.， 2021）。

两项独立研究在人肝细胞系 （Huh7） 中使用全基因组 CRISPR 敲除筛选，以确定 TMEM106B 是 SARS-CoV-2 感染所需的宿主因子（Baggen等人，2021 年;R. Wang 等人，2021 年）。在几种肝脏和肺细胞系中的验证证实，敲除 TMEM106B 减少了 SARS-CoV-2 感染，而重新添加TMEM106B挽救了感染。这种效果对 SARS-CoV-2 是特异性的，因为TMEM106B对于感染人类冠状病毒 HCoV-229E 或 HCoV-OC43 是必不可少的。一项后续研究确定，TMEM106B 的管腔结构域 （LD） 与 SARS-CoV-2 Spike 的 RBD 结合，并且 Spike 替换 （E484D） 增加了两者之间的结合，从而增强了感染（Baggen et al.， 2023）。不同的 SARS-CoV-2 变体利用TMEM106B进行感染，敲除硫酸乙酰肝素合成 （EXT1） 所需的基因抑制了 ACE2 依赖性和 TMEM106B 依赖性 SARS-CoV-2 感染，表明硫酸乙酰肝素有助于两种感染途径（Baggen 等人，2023 年）。最近的一项研究证实了 TMEM106B 在 ACE2 非依赖性作用在体外而不是体内促进 SARS-CoV-2 感染（Yan et al.， 2024）。在这里，小鼠适应的 SARS-CoV-2 毒株 （SARS-CoV-2

_MA1） 导致人脑类器官和表达人 ACE2 的小鼠具有更大的神经毒力。然而，SARS-CoV-2

_MA1不会增强野生型 （C57BL/6J） 小鼠的神经毒力，也不容易感染 ACE2 缺陷型 （Ace2

^−/−） 小鼠缺乏或表达人类TMEM106B。因此，这些结果使人们对 TMEM106B 在促进 ACE2 非依赖性 SARS-CoV-2 感染中的确切作用产生了怀疑。未来的研究应通过条件性缺失或药理学抑制解决 TMEM106B 在体内的贡献，并使用其他动物模型和不同的 SARS-CoV-2 毒株/变体概括 Yan 等人的结果。

4. SARS-CoV-2 进入：抑制性受体

抑制性受体是其表达减少 SARS-CoV-2 感染的蛋白质。因此，这些蛋白质起到抗病毒作用。下面我们描述了一种这样的蛋白质 LRRC15 及其对 SARS-CoV-2 感染的影响（表 2;图 2C).