抗体结合和 ACE2 结合抑制试验

从293T Expi细胞上清液中表达并纯化了构象稳定（6P）版本的SARS-CoV-2 S蛋白（Hsieh et al., 2020），其C末端附加了三聚化结构域、GGSGGn间隔序列、NanoLuc荧光素酶、Strep标签、HRV 3C蛋白酶切割位点和8XHis（S-6P-NanoLuc）。其突变体也进行了表达和纯化，用编码源自未修饰S表达质粒的RBD的序列进行替换。

抗体结合实验中，将20、40或80 ng S-6P-NanoLuc（或其突变体）与100 ng抗体C121、C135或C144（用LI-COR Intercept封闭缓冲液稀释）混合，在96孔板中以60 μl/孔的总体积进行混合。孵育30分钟后，向每孔加入10 μl蛋白G磁珠，孵育1.5小时。然后将磁珠洗涤三次，并用30 μl裂解缓冲液（Promega）进行孵育。最后，取15 μl裂解液用于测定结合的NanoLuc活性。

ACE2结合抑制试验中，将20 ng S-6P-NanoLuc与100 ng抗体C121、C135或C144混合，用3%山羊血清/PBS稀释，总体积为50 μl。孵育30分钟后，将混合物与1 × 10 5个293 T细胞或293T/ACE2cl.22细胞在4°C下孵育2小时。然后将细胞洗涤三次，并用30 μl裂解缓冲液裂解，取15 μl裂解液用于测定结合的NanoLuc活性。